Den svenske landslagsstjärnan ordnade själv straffen då han trycktes ned av hemmalagets back David Hancko i slutet av den första halvleken.
Gyökeres var säkerheten själv från straffpunkten och bombade in ledningsmålet bakom hemmamålvakten Jan Oblak.
Den svenske VM-playoffhjälten har varit utanför Arsenals startelva de senaste matcherna i Premier League, men när Kai Havertz saknades på grund av skada fick han förtroendet.
Det betalade av sig – innan Gyökeres byttes ut i 68:e minuten.
Målet var Gyökeres femte i Champions League den här säsongen – tre av dem har kommit mot Atletico Madrid. Lagen möttes även i seriespelet i höstas.
Men svenskens straffmål räckte inte hela vägen till seger.
Hemmalagets Julián Alvarez kvitterade från elvameterspunkten i 56:e minuten sedan Arsenalbacken Ben White tagit bollen med handen.
Domaren Danny Makkelie, Nederländerna, blåste för ytterligare en straff för Arsenal i 78:e minuten, sedan Hancko gjort ned Eberechi Eze. Men domaren ändrade sitt domslut efter VAR-granskning.
Returen i London spelas kommande tisdag.
I den andra semifinalen i tisdags vann Paris Saint-Germain över Bayern München med 5–4. Där spelas returen nästa onsdag.
