Löften om att göra rent hus med politisk korruption förde stormrike Babis och hans parti Ano till seger med nästan 30 procent i valet i oktober. Han fick uppdraget av president Milos Zeman att bilda regering men har haft svårt att få tillräckligt stöd i parlamentet.
Varje ny tjeckisk regering måste vinna en förtroendeomröstning i parlamentet inom 30 dagar, men han förlorade tisdagens omröstning med röstsiffrorna 78–117.
Presidenten har lovat honom ännu ett försök att bilda regering, men det är oklart vad som händer om Zeman själv förlorar i andra omgången av presidentvalet i slutet av januari.
Till Babis problem läggs även hotet om åtal för fusk med EU-stöd ett decennium tillbaka i tiden. När han omvaldes till parlamentet fick han immunitet mot åtal, men polisen har begärt att immuniteten ska hävas. Ett utskott rekommenderade på tisdagen att så ska ske. En omröstning i kammaren väntas inom de närmaste dagarna, och om det blir ja även där öppnar det för att polisen återupptar utredningen mot honom.
En talesman säger att regeringen kommer att upplösas på onsdagen, men sitter kvar som expeditionsregering under de kommande regeringsförhandlingarna.